호는 한힌샘·한흰메라 하였으며, 초명은 상호(相鎬)로 황해도 평산(平山)에서 출생하였다. 

1897년 배재학당 만국지지(萬國地誌)특별과를 졸업하고 보통과에 입학, 1900년 졸업하였다. 

그는 외래종교도 정신적 사대로 간주하고, 배재학당 졸업 당시 받은 예수교 세례를 버리고 대종교로 개종했으며, 이 정신 위에서 어문민족주의를 구현코자 했다.
1896년 독립협회(獨立協會) 조직에 참여하였고, 《독립신문》 교정원으로 일하면서 협성회(協成會)를 창립하여 《협성회보(協成會報)》를 발간하였고 또 조선문동식회(朝鮮文同式會)를 결성, 한글 기사체(記寫體)의 통일과 연구에 힘쓰는 한편, 여러 학교와 강습소의 교사·강사직을 맡아 한글을 가르치고 보급하기에 전력을 다했다. 

1898년 《국어문법(國語文法)》을 완성, 1910년 이를 수정·발간하였다. 

1905년 국어연구와 사전(辭典) 편찬사업에 관한 건의서를 정부에 제출하였고, 1907년 어윤적(魚允迪)·이능화(李能和) 등과 함께 학부(學部:교육부)의 국문연구소(國文硏究所) 위원이 되었다. 
우리말을 ‘배달글’이라 칭하고 후일 ‘한글’이라 명명한 사람도 주시경으로, 한글을 과학적으로 체계를 세워 국어학 중흥의 선구자가 되었다. 

한편 한글 보급에 정성을 기울여 김두봉(金枓奉)·이규영(李奎榮)·최현배(崔鉉培)·장지영(張志暎)·이병기(李秉岐) 등의 제자를 길러냈다. 

1921년에는 이들 문하생이 중심이 되어 조선어연구회(朝鮮語硏究會:한글학회의 전신)를 창설함으로써 1933년 드디어 ''''''''한글맞춤법통일안''''''''을 제정, 맞춤법의 과학적 연구가 결실을 보게 되었다. 저서로는 《국어문법》 《월남망국사》 《한문초습(漢文初習)》 《국어문전음학(國語文典音學)》 《국문초학(國文初學)》 《말의 소리》 등이 있다.